Schottland war zu dieser Zeit durch die Auseinandersetzungen zwischen Protestanten und Katholiken gespalten. 1582 wurde Jakob von einer Gruppe protestantischer Adliger unter der Führung von William Ruthven gefangen genommen. Erst ein Jahr später konnte er entkommen. 1586 schloss Jakob im Vertrag von Berwick ein Bündnis mit seiner Cousine, der englischen Königin Elisabeth I. Durch seine Heirat mit Anne von Dänemark 1589 näherte er sich zeitweise den Protestanten an. Nach der Gowrie-Verschwörung 1600 allerdings unterdrückte Jakob die Protestanten ebenso, wie er es zuvor mit den Katholiken getan hatte. Er schwächte die Feudalmacht des Adels durch eine starke Zentralmacht und festigte die Vorherrschaft des Staates über die Kirche, indem er das Gottesgnadentum für sich behauptete. Königin Elisabeth starb 1603 ohne Erben; kurz vor ihrem Tod hatte sie Jakob zu ihrem Nachfolger bestimmt, der als Jakob I. als Erster aus dem Hause Stuart den englischen Thron bestieg.
1604 beendete er den Krieg Englands gegen Spanien. Ebenfalls 1604 berief Jakob die Hampton Court Conference ein, bei der er eine neue Bibelübersetzung, die so genannte King James Version, authorisierte und zugleich die Forderung nach weiterreichenden Reformen zurückwies. Seine Härte gegen die Katholiken führte 1605 zur Pulververschwörung, die jedoch vorzeitig aufgedeckt wurde. Jakob unternahm erfolglose Versuche, den Religionsfrieden in Europa voranzubringen, indem er seine Tochter Elisabeth mit Kurfürst Friedrich V. von der Pfalz verheiratete, dem Führer der deutschen Protestanten, und indem er eine Ehe zwischen seinem Sohn Charles und der Infantin von Spanien, der führenden katholischen Macht, zu arrangieren versuchte. Dieses Heiratsangebot wurde jedoch von Spanien zurückgewiesen; daraufhin schloss Jakob eine Allianz mit Frankreich, erklärte Spanien den Krieg und schürte so das Feuer weiter, das er eigentlich hatte löschen wollen. Jakob I. starb am 27.  März 1625. Sein Nachfolger wurde sein Sohn Charles I.